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小鼠蘭尼定受體1(RYR1)ELISA試劑盒
簡介
蘭尼定受體1（RYR1）是一種位于肌質網(wǎng)膜上的鈣離子通道，主要在骨骼肌和心肌細胞中表達，對興奮-收縮耦聯(lián)過程至關重要，RYR1基因突變與多種疾病相關，包括惡性高熱、肌強直性營養(yǎng)不良、先天性肌病等。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物RYR1，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中RYR1的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
抗體工作液配置
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從800ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至40ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的40ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將40ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 40ng/mL、 20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從800ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至40ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的40ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將40ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 40ng/mL、 20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、
2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測樣本中RYR1濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù)。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。
|
標準品濃度(ng/mL) |
40 |
20 |
10 |
5 |
2.5 |
1.25 |
0.625 |
0 |
|
OD值 |
2.493 |
1.609 |
1.056 |
0.7 |
0.441 |
0.276 |
0.193 |
0.067 |
|
校正OD值 |
2.426 |
1.542 |
0.989 |
0.633 |
0.374 |
0.209 |
0.126 |
0 |
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
板內變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.31ng/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組小鼠RYR1。
